在(zai)線(xian)凈化與固(gu)相(xiang)萃取的(de)比(bi)較-簡(jian)單(dan)/方(fang)便(bian)

http://www.thermo.com.cn/Resources/201104/29123547853.pdf

在(zai)線(xian)凈化LC-MS/MS
系統(tong)對動(dong)物(wu)組(zu)織中克倫特(te)羅殘留的檢測分(fen)析(xi)
趙孔(kong)祥1 王(wang)海(hai)鑒(jian)2
1. 天(tian)津出入(ru)境檢驗(yan)檢(jian)疫局食(shi)檢(jian)中心(xin)；2. 賽默飛(fei)世(shi)爾科(ke)技(ji)（ 中國） 有限(xian)公(gong)司(si)
克倫特(te)羅俗稱(cheng)瘦(shou)肉精，常被(bei)用(yong)作(zuo)飼(si)料(liao)添(tian)加(jia)劑(ji)以(yi)提(ti)高(gao)家(jia)
畜的瘦(shou)肉含量(liang)，但(dan)由(you)於其嚴(yan)重(zhong)的毒(du)副作(zuo)用(yong)，歐(ou)盟於1988
年(nian)1 月(yue)1 日起禁(jin)止(zhi)鹽酸(suan)克倫特(te)羅物質(zhi)當飼(si)料(liao)添(tian)加(jia)劑(ji)使用(yong)。
1991 年(nian)被(bei)FDA 禁(jin)止(zhi)。1997 年(nian)，中華人民(min)共(gong)和(he)國農業部下
文嚴禁(jin)β- 腎(shen)上腺素(su)類激(ji)素在(zai)飼料(liao)和(he)畜牧(mu)生產中使用(yong)，鹽酸(suan)
克倫特(te)羅列為*位(wei)。2009 年(nian)7 月(yue)為應(ying)對日、韓從我(wo)國食(shi)
品(pin)中檢出鹽酸(suan)克倫特(te)羅事件(jian)，質(zhi)檢系(xi)統(tong)確(que)定(ding)了(le)了(le)更嚴(yan)格(ge)的
出口判(pan)定(ding)標準(zhun)（0.05μg/kg），食(shi)品(pin)檢(jian)測(ce)已經進(jin)入(ru)超(chao)痕量(liang)時代(dai)。
在(zai)此背景(jing)下，我(wo)們(men)需要更有效(xiao)的前(qian)處理手段(duan)以(yi)便(bian)我(wo)們(men)
得到(dao)更(geng)加(jia)濃縮(suo)更(geng)加純(chun)凈的樣品(pin)來(lai)提(ti)高(gao)我(wo)們(men)的信號降低我(wo)
們(men)的噪(zao)音。基(ji)於色(se)譜原(yuan)理的創新(xin)樣(yang)品(pin)制(zhi)備(bei)方(fang)法——Turbo
Flow 技(ji)術(shu)為我(wo)們(men)提(ti)供了(le)新(xin)的(de)思(si)路。這種(zhong)在線(xian)自(zi)動(dong)過(guo)程處理
技(ji)術(shu)結(jie)合(he)了(le)擴散(san)、化學和(he)體積(ji)排除的(de)原(yuan)理，在捕(bu)獲(huo)感興趣
分(fen)析(xi)物的同(tong)時，快速消除(chu)基(ji)質(zhi)幹(gan)擾。本(ben)實(shi)驗(yan)旨(zhi)在建立壹(yi)個
前(qian)處理簡(jian)單(dan)，選擇(ze)性靈(ling)敏度(du)高的(de)克倫特(te)羅的Turbo Flow 實(shi)
用(yong)在(zai)線凈化方(fang)法，並確(que)定(ding)該(gai)方(fang)法的檢(jian)出限(xian)。
1 實(shi)驗(yan)部分(fen)
1.1 樣(yang)品(pin)制(zhi)備(bei)
取5g 動(dong)物(wu)組(zu)織樣品(pin)與(yu)10mL 乙(yi)腈(jing)，10% 乙酸(suan)銨（1:3）
混合(he)溶(rong)液混(hun)勻勻漿10 分(fen)鐘(zhong)，5000r/min 離(li)心(xin)十(shi)分(fen)鐘(zhong)取(qu)
1mL 上清液經(jing)過(guo)0.22μm 註射過(guo)膜(mo)，上機。
1.2 Turbo Flow 條(tiao)件(jian)
系(xi)統(tong)：
Thermo Scientific Aria
TLX-1 controlled by Aria. software
在(zai)線凈化柱： Turbo Flow Cyclone MCX 0.5×50mm
進(jin)樣(yang)體積(ji)： 50μL
上樣(yang)溶(rong)劑(ji)： 0.1% 的(de)甲(jia)酸(suan)水溶(rong)劑(ji)
上樣(yang)流(liu)速： 2mL/min
洗(xi)脫(tuo)溶(rong)劑(ji)： 1%的(de)氨(an)水甲醇溶(rong)液
洗(xi)脫(tuo)體積(ji)： 50μL
1.3 HPLC 方(fang)法條件(jian)
色(se)譜柱(zhu)：Hypersil GOLD aQ 3μm 100 X 2.1mm
流路A ：0.1% 的甲(jia)酸(suan)水溶(rong)液
流(liu)路B ：甲醇(chun)
時間（min） A% B% 流(liu)速(su)mL/min
0 90 10 0.4
1 90 10 0.4
2.33 80 20 0.4
2.83 60 40 0.4
6 10 90 0.4
6.5 10 90 0.4
8 90 10 0.4
1.4 質(zhi)譜條(tiao)件(jian)
1.4.1 調(tiao)諧參數
系(xi)統(tong) TSQ Ultra AM
離(li)子源極(ji)性： 正離(li)子(zi)模式
噴霧電(dian)壓(ya)： 4500V
鞘氣壓(ya)（N2）： 50arb
輔(fu)助氣壓(ya)（N2）： 16arb
毛細(xi)管(guan)柱溫(wen)度(du)： 350°C
碰撞(zhuang)氣(qi)體（Ar）： 1.5mTorr
Skimmer offset 10V
Q1/Q3峰(feng)分(fen)辨(bian)度(du)： 0.7u （單(dan)位質(zhi)量(liang)）
1.4.2 SRM 反(fan)應(ying)參數(shu)
被(bei)分(fen)析(xi)組(zu)分(fen)
母(mu)離(li)子(zi)
（m/z）
子(zi)離(li)子
（m/z）
碰撞(zhuang)能量(liang)
（V）
管(guan)透(tou)鏡(jing)電(dian)壓(ya)
（V）
克倫特(te)羅-D9 286 169.1 28 104
克倫特(te)羅277 132.2 29 94
168.1* 28 94
203.6 15 94
* 為定(ding)量(liang)離(li)子(zi)
2 結(jie)果(guo)與討(tao)論
食(shi)物(wu)樣品(pin)本(ben)身基(ji)質(zhi)比(bi)較復(fu)雜(za)，在(zai)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)之(zhi)前(qian)往往(wang)
需要壹(yi)個較(jiao)長(chang)的(de)樣品(pin)預(yu)處理過程。比(bi)如賈(jia)曉飛(fei)等使用(yong)酶
解(jie)，高(gao)氯(lv)酸(suan)沈(chen)澱(dian)蛋(dan)白，邵兵等應(ying)用(yong)HLB 和(he)MCX 兩次(ci)SPE
對食(shi)品(pin)中β2- 受體激(ji)動(dong)劑(ji)進(jin)行(xing)殘(can)留(liu)檢測都取(qu)得了(le)很(hen)好(hao)的(de)效(xiao)
果，這些(xie)方(fang)法的目(mu)的也都是為了(le)獲得更(geng)加(jia)濃縮(suo)和(he)純凈的樣
品(pin)。應(ying)用(yong)Turbo-Flow 在(zai)線凈化技(ji)術(shu)使得這些(xie)工(gong)作(zuo)變(bian)得更(geng)加(jia)
圖1 Turbo Flow 在(zai)線凈化與HPLC 聯用(yong)方(fang)法參數(shu)
熱點(dian)聚(ju)焦(jiao) Hotspot
簡(jian)潔(jie)方(fang)便(bian)，減(jian)少(shao)了(le)中間步(bu)驟和(he)偶(ou)然誤差(cha)，使得加(jia)標(biao)回(hui)收(shou)的
重復(fu)性很(hen)穩(wen)定(ding)，0.05μg/kg 濃度(du)下六(liu)平行(xing)RSD 為5.36% ；
同(tong)時由(you)於樣品(pin)更(geng)加(jia)純(chun)凈濃縮(suo)，幹(gan)擾較(jiao)少(shao)，此方(fang)法在添(tian)加(jia)量(liang)
為0.02μg/kg 濃度(du)下峰(feng)型(xing)良(liang)好(hao)（ 如(ru)圖2 所(suo)示）。根(gen)據(ju)歐(ou)盟
法規計(ji)算此(ci)方(fang)法檢出限(xian)（LOD） 為0.002μg/kg，定(ding)量(liang)限(xian)為
0.006μg/kg 已經能輕松應(ying)對實(shi)際需(xu)要。同時如果(guo)有(you)實(shi)際
需(xu)要，可(ke)以(yi)采用(yong)更(geng)長的凈化柱（100mm 規格(ge)） 或者(zhe)采(cai)用(yong)串(chuan)
聯(lian)凈化柱的方(fang)法進(jin)壹(yi)步(bu)增加(jia)樣(yang)品(pin)濃縮(suo)倍(bei)數，來(lai)提(ti)高(gao)檢(jian)出限(xian)。
由(you)於采用(yong)了(le)在線(xian)凈化系統(tong)，進(jin)入(ru)分(fen)析(xi)色(se)譜柱(zhu)的樣(yang)品(pin)也更
圖2 0.02μg/kg 濃度(du)色(se)譜圖
圖3 20pg/g 添(tian)加(jia)回(hui)收(shou)比(bi)較圖。左圖為MCX 固(gu)相(xiang)萃取凈化，右圖為在(zai)線凈化結(jie)果(guo)
為純(chun)凈，壹(yi)定(ding)程度(du)上降(jiang)低了(le)噪(zao)音和(he)雜(za)峰(feng)的(de)產生。如(ru)圖3 所(suo)示，
采用(yong)Turbo Flow 技(ji)術(shu)壹(yi)定(ding)程度(du)上起到(dao)了(le)穩定(ding)基(ji)線(xian)的作(zuo)用(yong)。
運(yun)用(yong)Transcend 在(zai)線凈化系統(tong)的(de)操作(zuo)軟(ruan)件(jian)Aria OS 的(de)
變量(liang)設置功能，可(ke)以(yi)方(fang)便(bian)設置批處理程序(xu)嘗(chang)試(shi)不同(tong)的(de)洗(xi)
脫(tuo)溶(rong)液。在(zai)比(bi)較不同(tong)濃度(du)的氨(an)水甲醇溶(rong)液後(hou)，結(jie)果(guo)表(biao)明
1% 的氨(an)水甲醇溶(rong)液作(zuo)為洗(xi)脫(tuo)溶(rong)液的(de)效(xiao)果*。使用(yong)外
標(biao)法計(ji)算其(qi)與不經(jing)過(guo)凈化柱的結(jie)果(guo)得到(dao)其(qi)回(hui)收(shou)率(lv)為
79%~84%。而(er)且(qie)此(ci)濃度(du)的氨(an)水甲醇溶(rong)液以(yi)0.2mL/min 的(de)
速度(du)與0.4mL/min 的(de)分(fen)析(xi)柱溶(rong)液混(hun)合(he)不會(hui)對液相(xiang)色(se)譜
產生不良(liang)影響，在使用(yong)此(ci)方(fang)法千(qian)針後，10 個(ge)平行(xing)的(de)保(bao)留
時間RSD 仍(reng)然(ran)只有0.1%。
分(fen)別(bie)配置5pg/mL，10pg/mL，20pg/mL，50pg/mL，
100pg/mL，200pg/mL，500pg/mL，1ng/mL，2ng/mL
的(de)克倫特(te)羅標準溶(rong)液，其(qi)中都混(hun)有(you)100pg/mL 內(nei)標，內(nei)標
法定(ding)量(liang)得到(dao)標(biao)準(zhun)曲(qu)線有(you)很(hen)好(hao)的(de)線(xian)性（ 曲(qu)線見圖3），相(xiang)關(guan)系(xi)
數(shu)R2 為0.9995
向(xiang)5g 動(dong)物(wu)組(zu)織中分(fen)別(bie)添(tian)加(jia)100pg、250pg、500pg
克倫特(te)羅標準，內(nei)標法定(ding)量(liang)，計(ji)算其(qi)回收(shou)率(lv)結(jie)果(guo)表(biao)明，經
過(guo)在線(xian)凈化和(he)內(nei)標法校正後(hou)樣(yang)品(pin)回(hui)收(shou)率(lv)非常(chang)穩(wen)定(ding)。簡(jian)單(dan)的
前(qian)處理步(bu)驟帶(dai)來(lai)zui少(shao)的偶(ou)然誤差(cha)。
表(biao)1 克倫特(te)羅不同(tong)添(tian)加(jia)水平回(hui)收(shou)率(lv)
添(tian)加(jia)水平平均(jun)回(hui)收(shou)率(lv)% RSD%*
20pg/g 94.2 5.58
50pg/g 96.5 5.36
100pg/g 94.4 2.49
* 為六(liu)平行(xing)水平下(xia)RSD 值
3 結(jie)論
采用(yong)Turbo Flow 在(zai)線凈化技(ji)術(shu)可(ke)以(yi)非常方(fang)便(bian)的(de)按(an)要求
得到(dao)更(geng)加(jia)濃縮(suo)，幹(gan)擾更(geng)少(shao)的樣品(pin)，提(ti)高(gao)了(le)信噪(zao)比(bi)，降低了(le)
檢出限(xian)。
Turbo Flow 圖4 克倫特(te)羅標準曲(qu)線在(zai)線凈化技(ji)術(shu)簡(jian)化(hua)了(le)前(qian)處理步(bu)驟，減(jian)少(shao)了(le)
熱點(dian)聚焦(jiao) Hotspot
偶(ou)然誤差(cha)獲得了(le)令(ling)人滿意的重(zhong)現(xian)性。
使用(yong)Aria OS 操作(zuo)系(xi)統(tong)，我(wo)們(men)可(ke)以(yi)很(hen)方(fang)便(bian)的(de)設置批處
理變量(liang)，嘗(chang)試(shi)不同(tong)種(zhong)類或者(zhe)比(bi)例的上樣(yang)或(huo)者(zhe)洗(xi)脫(tuo)溶(rong)劑(ji)。
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