如(ru)何(he)選擇(ze)適(shi)合(he)的(de)高(gao)效液相色(se)譜(pu)柱？

 

壹、明確(que)分(fen)離模(mo)式(shi)：根(gen)據(ju)樣品(pin)性(xing)質(zhi)選擇(ze)核心(xin)色譜(pu)類(lei)型(xing)

 

高(gao)效液相色(se)譜(pu)的(de)分(fen)離(li)模(mo)式(shi)決定(ding)了色(se)譜(pu)柱的(de)核(he)心(xin)分離原理，需根(gen)據(ju)樣品(pin)的(de)極(ji)性(xing)、分子量(liang)、電荷特性(xing)等(deng)關(guan)鍵(jian)性(xing)質(zhi)選擇(ze)適(shi)配(pei)的分(fen)離模(mo)式(shi)，這是色譜(pu)柱選型(xing)的(de)第(di)壹步。

 

反(fan)相色(se)譜(pu)（RP-HPLC）這(zhe)是很常(chang)用(yong)的(de)分(fen)離模(mo)式(shi)，適(shi)用(yong)於(yu)絕(jue)大(da)多數非(fei)極性(xing)至中(zhong)等(deng)極(ji)性(xing)的有(you)機(ji)化(hua)合(he)物，如(ru)藥物、農(nong)藥、食(shi)品(pin)添加劑(ji)、環境(jing)汙(wu)染(ran)物等(deng)。其(qi)分(fen)離(li)原(yuan)理基於(yu)樣(yang)品(pin)中(zhong)各(ge)組(zu)分與非(fei)極性(xing)固(gu)定(ding)相（如(ru)C18、C8）的疏(shu)水相互作(zuo)用(yong)差(cha)異，極(ji)性(xing)越強(qiang)的組(zu)分越先(xian)洗(xi)脫(tuo)，極(ji)性(xing)越弱(ruo)的組(zu)分保留時(shi)間越(yue)長(chang)。若樣(yang)品(pin)為中(zhong)性(xing)或(huo)弱極(ji)性(xing)有機(ji)物，優(you)先(xian)選擇(ze)反(fan)相色(se)譜(pu)柱，這(zhe)是通(tong)用(yong)性(xing)很強的分離(li)模(mo)式(shi)，實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)易(yi)優(you)化(hua)，重(zhong)現性(xing)好(hao)。

 

正相色(se)譜(pu)（NP-HPLC）適(shi)用(yong)於(yu)分(fen)離(li)極(ji)性(xing)較(jiao)強的化(hua)合(he)物，如(ru)糖類、氨(an)基(ji)酸、維(wei)生素(su)、極性(xing)藥物(wu)中間體等(deng)。分(fen)離(li)原(yuan)理基於(yu)樣(yang)品(pin)組(zu)分與極(ji)性(xing)固(gu)定(ding)相（如(ru)矽(gui)膠、氨基(ji)柱、氰(qing)基柱）的(de)極(ji)性(xing)相互作(zuo)用(yong)（氫(qing)鍵、dipole-dipole作(zuo)用(yong)），極(ji)性(xing)越弱(ruo)的組(zu)分越先(xian)洗(xi)脫(tuo)，極(ji)性(xing)越強(qiang)的組(zu)分保留時(shi)間越(yue)長(chang)。若樣(yang)品(pin)極(ji)性(xing)強、在反(fan)相色(se)譜(pu)中(zhong)保留過強或(huo)分離(li)效(xiao)果差(cha)，可選擇(ze)正相色(se)譜(pu)柱，尤其(qi)適(shi)合(he)異(yi)構體分離。

 

離(li)子交換(huan)色譜(pu)（IEC）適(shi)用(yong)於(yu)分(fen)離(li)離(li)子型(xing)化(hua)合(he)物或(huo)可電離的化(hua)合(he)物，如(ru)有機(ji)酸、生物堿、氨基(ji)酸、蛋白(bai)質(zhi)、核(he)酸等(deng)。分(fen)離(li)原(yuan)理基於(yu)樣(yang)品(pin)離(li)子與(yu)固(gu)定(ding)相表(biao)面(mian)的離(li)子交換(huan)基團發生可逆的離(li)子交換(huan)反(fan)應，根(gen)據(ju)離子電荷數和(he)離(li)子半(ban)徑(jing)的差(cha)異實(shi)現分離。若樣(yang)品(pin)為帶(dai)電物質(zhi)，需(xu)選擇(ze)對應的離(li)子交換(huan)色譜(pu)柱（陽(yang)離(li)子交換(huan)柱用(yong)於(yu)分(fen)離(li)帶(dai)正電的組(zu)分，陰離子交換(huan)柱用(yong)於(yu)分(fen)離(li)帶(dai)負電的組(zu)分）。

 

體積排(pai)阻色譜(pu)（SEC）適(shi)用(yong)於(yu)分(fen)離(li)大(da)分子化(hua)合(he)物，如(ru)蛋白質(zhi)、多肽(tai)、多糖(tang)、聚合物(wu)等(deng)，主(zhu)要用(yong)於(yu)測(ce)定(ding)分(fen)子量(liang)分布和純(chun)度檢測(ce)。分(fen)離原理基於(yu)樣(yang)品(pin)分(fen)子的(de)尺(chi)寸差(cha)異，小(xiao)分(fen)子可(ke)進入(ru)固(gu)定(ding)相的(de)孔道，保留時(shi)間長(chang)；大(da)分(fen)子無(wu)法進入孔道，直接(jie)被(bei)洗脫(tuo)，保留時(shi)間短(duan)。若樣(yang)品(pin)為大(da)分(fen)子物(wu)質(zhi)，且需(xu)按分子量(liang)大小(xiao)分離(li)，選擇(ze)體積排(pai)阻色譜(pu)柱，避(bi)免(mian)大分子在其(qi)他(ta)色(se)譜(pu)柱中(zhong)吸(xi)附(fu)或(huo)降(jiang)解。

 

二(er)、細化(hua)色(se)譜(pu)柱參數：匹(pi)配(pei)分離(li)需求與(yu)儀(yi)器(qi)條(tiao)件(jian)

 

確(que)定(ding)分(fen)離模(mo)式(shi)後，需進(jin)壹步選擇(ze)色譜(pu)柱的(de)關(guan)鍵參數，包(bao)括固(gu)定(ding)相、柱尺(chi)寸、粒徑(jing)、孔徑(jing)等(deng)，這(zhe)些(xie)參數直接(jie)影(ying)響(xiang)分(fen)離(li)效率(lv)、分析(xi)速(su)度和檢(jian)測(ce)靈(ling)敏度。

 

（壹）固(gu)定(ding)相選擇(ze)：核心(xin)分離性(xing)能的(de)決定(ding)性(xing)因素(su)

 

反(fan)相色(se)譜(pu)柱固(gu)定(ding)相

 

C18（十(shi)八烷(wan)基(ji)矽(gui)烷(wan)）：應用(yong)很廣泛(fan)的(de)固(gu)定(ding)相，疏(shu)水性(xing)強，適(shi)合(he)分(fen)離(li)絕大多數非(fei)極性(xing)和中(zhong)等(deng)極(ji)性(xing)化(hua)合(he)物，如(ru)藥物、環境(jing)汙(wu)染(ran)物、食(shi)品(pin)添加劑(ji)等(deng)，通(tong)用(yong)性(xing)強，穩(wen)定(ding)性(xing)好(hao)。

 

C8（辛烷(wan)基(ji)矽(gui)烷(wan)）：疏(shu)水性(xing)弱於(yu)C18，適(shi)合(he)分(fen)離(li)極性(xing)稍強的化(hua)合(he)物，或(huo)在C18柱上(shang)保留過強的(de)樣(yang)品(pin)，可(ke)縮(suo)短(duan)保留時(shi)間，提(ti)高(gao)分(fen)析(xi)效率(lv)。

 

苯(ben)基柱：除疏(shu)水作(zuo)用(yong)外(wai)，還(hai)存在π-π相互作(zuo)用(yong)，適(shi)合(he)分(fen)離(li)含有(you)苯(ben)環、共(gong)軛(e)雙(shuang)鍵等(deng)芳(fang)香(xiang)族(zu)化(hua)合(he)物，能(neng)提(ti)供(gong)與C18不(bu)同的選擇(ze)性(xing)，改(gai)善異(yi)構體分離效(xiao)果。

 

極性(xing)嵌入(ru)相柱：在烷(wan)基(ji)鏈(lian)中(zhong)嵌(qian)入(ru)極性(xing)基團（如(ru)氨基、酰(xian)胺(an)基），適(shi)合(he)分(fen)離(li)極性(xing)化(hua)合(he)物，同時(shi)兼(jian)容(rong)100%水相流(liu)動相，避(bi)免(mian)疏(shu)水塌(ta)陷(xian)。

 

正(zheng)相色(se)譜(pu)柱固(gu)定(ding)相

 

矽(gui)膠柱：極(ji)性(xing)很強的固(gu)定(ding)相，適(shi)合(he)分(fen)離(li)強極性(xing)化(hua)合(he)物，如(ru)糖類、有(you)機(ji)酸等(deng)，但(dan)需(xu)註(zhu)意流動相含水量(liang)，含水量(liang)過高會(hui)導致保留時(shi)間漂(piao)移(yi)。

 

氨(an)基柱（-NH₂）：適(shi)合(he)分(fen)離(li)糖類、核苷類(lei)化(hua)合(he)物，同時(shi)也(ye)可作(zuo)為反(fan)相或(huo)離子交換(huan)柱使(shi)用(yong)，通(tong)用(yong)性(xing)較(jiao)強。

 

氰(qing)基柱（-CN）：極(ji)性(xing)弱於(yu)矽(gui)膠和氨(an)基柱，適(shi)合(he)分(fen)離(li)中等(deng)極(ji)性(xing)化(hua)合(he)物，能(neng)提(ti)供(gong)獨(du)特的(de)選擇(ze)性(xing)，尤其(qi)適(shi)合(he)異(yi)構體分離。

 

離(li)子交換(huan)色譜(pu)柱固(gu)定(ding)相

 

陽(yang)離(li)子交換(huan)柱：固(gu)定(ding)相帶(dai)有(you)磺酸基（-SO₃H）、羧(suo)基(ji)（-COOH）等(deng)酸性(xing)基團，用(yong)於(yu)分(fen)離(li)陽(yang)離子（如(ru)金屬離(li)子、生物堿），其(qi)中(zhong)磺(huang)酸基為強(qiang)陽(yang)離子交換(huan)基團，適(shi)用(yong)pH範(fan)圍廣(guang)；羧基(ji)為弱(ruo)陽(yang)離子交換(huan)基團，適(shi)合(he)分(fen)離(li)弱酸堿性(xing)化(hua)合(he)物。

 

陰離子交換(huan)柱：固(gu)定(ding)相帶(dai)有(you)季銨基（-N(CH₃)₃⁺）等(deng)堿(jian)性(xing)基團，用(yong)於(yu)分(fen)離(li)陰離子（如(ru)有機(ji)酸、核酸），季銨基為強(qiang)陰離子交換(huan)基團，穩(wen)定(ding)性(xing)好(hao)，適(shi)用(yong)pH範(fan)圍廣(guang)。

 

（二）柱尺(chi)寸選擇(ze)：平(ping)衡(heng)分(fen)離(li)效率(lv)與分析(xi)速(su)度

 

常(chang)規分析(xi)柱：長(chang)度150-250mm，內徑4.6mm，這是很常(chang)用(yong)的(de)柱尺(chi)寸，分離(li)效率(lv)高，適(shi)合(he)絕(jue)大(da)多數常(chang)規分析(xi)，能滿(man)足(zu)復雜樣品(pin)的(de)分(fen)離(li)需(xu)求，但(dan)分(fen)析(xi)時(shi)間較(jiao)長，流動相消(xiao)耗量大(da)。

 

快(kuai)速(su)分(fen)析(xi)柱：長(chang)度50-100mm，內徑2.1-4.6mm，分離效率(lv)略(lve)低(di)於(yu)常(chang)規柱，但(dan)分(fen)析(xi)時(shi)間可(ke)縮(suo)短(duan)50%以上(shang)，流(liu)動相消(xiao)耗量減(jian)少(shao)，適(shi)合(he)高(gao)通(tong)量分(fen)析(xi)或(huo)快(kuai)速(su)篩查(zha)實(shi)驗(yan)。

 

微徑柱（窄(zhai)徑(jing)柱）：內徑2.1mm，長度100-150mm，分離(li)效(xiao)率(lv)與常(chang)規柱相當(dang)，但流(liu)動相消(xiao)耗量僅(jin)為常(chang)規柱的(de)1/5-1/10，適(shi)合(he)與(yu)質(zhi)譜(pu)（MS）聯(lian)用(yong)，減(jian)少(shao)流動相對質(zhi)譜(pu)離(li)子源的汙(wu)染(ran)，同時(shi)提(ti)高(gao)檢(jian)測(ce)靈(ling)敏度。

 

制備(bei)柱：內徑大於(yu)10mm，長(chang)度150-250mm，柱容(rong)量大(da)，適(shi)合(he)樣(yang)品(pin)制(zhi)備(bei)和(he)純(chun)化(hua)，用(yong)於(yu)從(cong)混(hun)合(he)物中分離純(chun)化(hua)目(mu)標化(hua)合(he)物。

 

（三(san)）填(tian)料粒(li)徑(jing)與孔徑(jing)：優(you)化(hua)分(fen)離效(xiao)率(lv)與樣品(pin)兼(jian)容(rong)性(xing)

 

填料粒(li)徑(jing)：常(chang)見粒(li)徑有1.8μm、3μm、5μm等(deng)，粒(li)徑(jing)越(yue)小，柱效(xiao)越(yue)高，分離(li)效(xiao)果越好(hao)，但柱壓(ya)也(ye)越高(gao)，對儀器(qi)的耐(nai)壓(ya)要(yao)求也(ye)越高(gao)。

 

5μm粒徑：常(chang)規分析(xi)的選擇(ze)，柱壓(ya)適(shi)中(zhong)（約(yue)10-20MPa），分(fen)離效率(lv)滿足(zu)常(chang)規需求，對儀器(qi)要求較(jiao)低(di)，使用(yong)壽命長。

 

3μm粒徑(jing)：柱效(xiao)高(gao)於(yu)5μm，適(shi)合(he)復(fu)雜樣品(pin)的(de)分(fen)離(li)，柱壓(ya)略(lve)高(gao)（約(yue)20-30MPa），需(xu)配(pei)備(bei)高(gao)壓(ya)液相色(se)譜(pu)儀(yi)。

 

1.8μm粒(li)徑(jing)：超(chao)高(gao)效(xiao)液相色(se)譜(pu)（UPLC）專用(yong)，柱效(xiao)很高，分離速(su)度快(kuai)，但柱壓(ya)高(gao)達(da)40-60MPa，需(xu)使(shi)用(yong)耐(nai)高(gao)壓(ya)的(de)UPLC系(xi)統(tong)。

 

填(tian)料孔徑(jing)：孔徑(jing)大小(xiao)決定(ding)了樣(yang)品(pin)分(fen)子能(neng)否進(jin)入(ru)固(gu)定(ding)相內部，直接(jie)影(ying)響(xiang)保留和分離效(xiao)果。

 

常(chang)規孔徑(jing)（80-120Å）：適(shi)合(he)分(fen)離(li)小分子化(hua)合(he)物（分(fen)子量(liang)＜1000），如(ru)藥物、農(nong)藥、有(you)機(ji)酸等(deng)，是很常(chang)用(yong)的(de)孔徑(jing)規格。

 

大(da)孔徑(jing)（300Å及以上(shang)）：適(shi)合(he)分(fen)離(li)大分子化(hua)合(he)物（分(fen)子量(liang)＞1000），如(ru)蛋白質(zhi)、多肽(tai)、聚合物(wu)等(deng)，避(bi)免(mian)大(da)分子無(wu)法進入孔道而(er)導致無(wu)保留或(huo)分離(li)效(xiao)果差(cha)。