反(fan)相液(ye)相色(se)譜法測(ce)定巴洛沙(sha)星(xing)有關物(wu)質(zhi)的(de)方法(fa)學(xue)研(yan)究

摘(zhai)要(yao)】  目的(de)  采用RP-HPLC法(fa)測(ce)定巴洛沙(sha)星(xing)的(de)有關物(wu)質(zhi)。  使用SMT C18柱(zhu)（250mm×4.6mm，5μm）， 流(liu)動相為(wei)乙腈(jing)-0.4%十二烷(wan)基硫(liu)酸(suan)鈉(na)溶液(ye)（47：53）［用枸(gou)櫞(yuan)酸(suan)（1.5mol/L）調(tiao)pH值(zhi)至(zhi)3.0］，檢測(ce)波(bo)長為295nm，流(liu)速(su)為1.0ml/min。結(jie)果  巴洛沙(sha)星(xing)與各有關物(wu)質(zhi)在(zai)上述色(se)譜條(tiao)件(jian)下(xia)能有效(xiao)地(di)分離(li)。結論(lun)  該(gai)方(fang)法結(jie)果準確、操作簡(jian)單、靈敏度高、專屬(shu)性(xing)強(qiang)，適(shi)用於(yu)巴洛沙(sha)星(xing)的(de)有關物(wu)質(zhi)測(ce)定。
   
    【關鍵(jian)詞(ci)】  巴洛沙(sha)星(xing)；反相液(ye)相色(se)譜法
   
    Study on determination of related substances in balofloxacin by RP- HPLC
    
    【Abstract】  Objective  reversed phase high performance liquid chromatography method was established to determine the related substances in balofloxacin.Methods  The column is SMT C18（250mm×4.6mm×5μm）.The phase is compound solution of acetonitrile and 0.4% lauryl sodium sulfate（47：53）［adjusted pH to 3.0 by citric acid（1.5mol/L）］， the detection wave length is 295nm， the flow rate is 1.0ml/min. Balofloxacian and all of the related substances can be separated efficiently with this determineation of the related substances in balofloxacin. The column is SMT C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The phase is compound solution of acetonitrile and 0.4% lauryl sodium sulfate（47：53） ［adjusted pH to 3.0 by citric acid（1.5mol/L）］， the detection wave length is 295nm， the flow rate is 1.0ml/min. Results  Balofloxacian and all of the related substances can be separated efficiently with this condition. The method is accurate， simple ，rapid and exclusive.Conclusion  It could be used for determination of  related substances in balofloxacin.
   
    【Key words】  balofloxacin；reversed phase high performance liquid chromatography
   
    巴洛沙(sha)星(xing)（balofloxacin）系(xi)由日(ri)本(ben)中外制藥株式會(hui)社與(yu)韓(han)國Choongwae公(gong)司共同開發的(de)氟喹(kui)諾(nuo)酮類(lei)抗菌(jun)藥，於(yu)2002年(nian)在(zai)韓(han)國上(shang)市［1～2］。對(dui)革(ge)蘭陽性(xing)菌(jun)、革(ge)蘭陰(yin)性(xing)菌(jun)及厭氧(yang)菌(jun)具有廣(guang)譜抗菌(jun)活性(xing)，對(dui)細菌(jun)具有選(xuan)擇(ze)性(xing)抑(yi)制(zhi)作用，體外抗菌(jun)活性(xing)是(shi)環丙沙星(xing)、氧(yang)氟沙星(xing)和洛美沙(sha)星(xing)的(de)4～16倍(bei)［3］；與托氟(fu)沙星(xing)和司帕沙(sha)星(xing)類似(si)［4］。由於(yu)巴洛沙(sha)星(xing)在(zai)其母核(he)的(de)8位(wei)引(yin)入了壹甲(jia)氧(yang)基，使(shi)其不僅(jin)增加(jia)了對(dui)革(ge)蘭陽性(xing)菌(jun)的(de)抗菌(jun)活性(xing)，而(er)且避免(mian)或(huo)減(jian)少(shao)光過敏(min)或光(guang)毒性(xing)及細胞毒(du)性(xing)［5］。巴洛沙(sha)星(xing)是以羧酸(suan)乙酯(zhi)為起始原料(liao)，先和三(san)乙酸(suan)硼反應(ying)生成(cheng)螯合物(wu)Ⅰ，再(zai)和3-甲(jia)胺基哌啶(ding)二(er)鹽(yan)酸(suan)鹽(yan)縮(suo)合反(fan)應(ying)得(de)螯合物(wu)Ⅱ，然後水(shui)解制(zhi)得(de)。該(gai)路線(xian)是(shi)制(zhi)備(bei)巴洛沙(sha)星(xing)的(de)*路線(xian)［6］。測(ce)定巴洛沙(sha)星(xing)的(de)有關物(wu)質(zhi)常用液(ye)相色(se)譜法，俞紅(hong)等［7］報(bao)道，用流(liu)動相為(wei)0.05mol/L檸(ning)檬(meng)酸(suan)-乙腈(jing)（60：40）［三(san)乙胺調(tiao)pH=4］的(de)反相(xiang)液(ye)相色(se)譜法測(ce)定主(zhu)要(yao)中間(jian)體羧(suo)酸(suan)乙酯(zhi)在(zai)巴洛沙(sha)星(xing)中的(de)含量(liang)。本(ben)實驗(yan)通過(guo)摸索新的(de)色(se)譜條(tiao)件(jian)，采(cai)用乙(yi)腈-0.4%十二烷(wan)基硫(liu)酸(suan)鈉(na)溶液(ye)為流(liu)動相的(de)液(ye)相色(se)譜法，能同時測(ce)定了(le)巴洛沙(sha)星(xing)的(de)合成(cheng)中間(jian)體羧(suo)酸(suan)乙酯(zhi)、螯合物(wu)Ⅰ及螯合物(wu)Ⅱ。該(gai)方(fang)法簡(jian)單準確(que)、分離(li)效(xiao)果好，對(dui)巴洛沙(sha)星(xing)的(de)質量(liang)控(kong)制(zhi)具(ju)有明顯(xian)的(de)實用價值。巴洛沙(sha)星(xing)及各中間(jian)體的(de)結構(gou)式如(ru)圖1所示(shi)。
   
    1  實驗(yan)部(bu)分
   
    1.1  儀器與(yu)試劑(ji)  液(ye)相色(se)譜儀—Waters 515泵；2487紫(zi)外檢測(ce)器。巴洛沙(sha)星(xing)樣(yang)品(pin)自(zi)制，樣(yang)品(pin)批號(hao)：20041015、20041020、20041024；對(dui)照品(pin)自(zi)制，含(han)量：99.7%；羧酸(suan)乙酯(zhi)（江(jiang)陰(yin)市永(yong)達(da)化(hua)工有限(xian)公(gong)司），螯合物(wu)Ⅰ、螯合物(wu)Ⅱ均自(zi)制；乙(yi)腈為色(se)譜純(chun)試劑(ji)，其他(ta)試劑(ji)均為(wei)純(chun)試劑(ji)。
   
    1.2  實驗(yan)溶液(ye)的(de)制備(bei)  供(gong)試品(pin)溶液(ye)：取(qu)巴洛沙(sha)星(xing)（批號(hao)：20041024）約(yue)10.2mg，置(zhi)100ml量瓶(ping)中，加流(liu)動相溶(rong)解並(bing)稀釋(shi)至(zhi)刻度(du)，搖勻，即(ji)得(de)；中間(jian)體溶(rong)液(ye)：取(qu)羧酸(suan)乙酯(zhi)14.0mg、螯合物(wu)Ⅰ11.3mg、螯合物(wu)Ⅱ10.3mg，分別(bie)置100ml量(liang)瓶(ping)中，加流(liu)動相溶(rong)解並(bing)稀釋(shi)至(zhi)刻度(du)，搖勻，即(ji)得(de)；混(hun)合溶(rong)液(ye)：取(qu)供試品(pin)溶液(ye)及各中間(jian)體溶(rong)液(ye)各1份，混合，即(ji)得(de)。

 

圖1  巴洛沙(sha)星(xing)及中間(jian)體的(de)結構(gou)式
Fig. 1 Structural formula of balofloxacin and intermediates
1-巴洛沙(sha)星(xing)；2-羧酸(suan)乙酯(zhi)；3-螯合物(wu)Ⅰ；4-螯合物(wu)Ⅱ1.3  色(se)譜條(tiao)件(jian)  色(se)譜柱(zhu)：SMT C18柱(zhu)（5μm，4.6mm×250mm）；流(liu)動相：乙(yi)腈-0.4%十二烷(wan)基硫(liu)酸(suan)鈉(na)溶液(ye)（47：53）［用枸(gou)櫞(yuan)酸(suan)（1.5mol/L）調(tiao)pH值(zhi)至(zhi)3.0］；檢測(ce)波(bo)長：295nm；流(liu)速(su)：1.0ml/min；柱(zhu)溫：室溫；進樣(yang)量(liang)：20μl。

    2  結果與討(tao)論(lun)
   
    2.1  測(ce)定波(bo)長的(de)選(xuan)擇(ze)  分別(bie)稱取(qu)巴洛沙(sha)星(xing)及各中間(jian)體適(shi)量(liang)，分別(bie)加乙(yi)腈溶解制(zhi)成(cheng)每1ml中約(yue)含(han)6μg的(de)溶液(ye)，照分光(guang)光度(du)法（藥典(dian)2000年(nian)版二部(bu)附(fu)錄(lu)ⅣA），在(zai)200～400nm的(de)波(bo)長處(chu)掃(sao)描(miao)，結(jie)果顯示巴洛沙(sha)星(xing)在(zai)295nm處(chu)吸(xi)收zui強，且其他(ta)中間(jian)體在(zai)295nm附(fu)近有較大(da)的(de)吸收，故選(xuan)擇(ze)295nm為本(ben)品(pin)有關物(wu)質(zhi)測(ce)定的(de)檢測(ce)波(bo)長。
   
    2.2  色(se)譜柱(zhu)及流(liu)動相的(de)選(xuan)擇(ze)  色(se)譜柱(zhu)：（1）DiamonsilTM C18柱(zhu)（5μm， 4.6mm×200mm）；（2）Kromasil C18柱(zhu)（5μm， 4.6mm×200mm）；（3）SMT C18柱(zhu)（5μm， 4.6mm×250mm）。流(liu)動相：（1）參(can)照中國藥典(dian)2000年(nian)版二部(bu)沙星(xing)類藥物(wu)有關物(wu)質(zhi)測(ce)定，采(cai)用流(liu)動相：乙(yi)腈-0.05mol/L枸(gou)櫞(yuan)酸(suan)溶液(ye)（20： 80）［用三(san)乙胺調(tiao)pH值(zhi)至(zhi)3.5］；（2）乙腈(jing)—0.4%十二烷(wan)基硫(liu)酸(suan)鈉(na)溶液(ye)（47：53）［用枸(gou)櫞(yuan)酸(suan)（1.5mol/L）調(tiao)pH值(zhi)至(zhi)3.0］。
   
    采用上(shang)述不同的(de)色(se)譜柱(zhu)和流(liu)動相進(jin)行(xing)實驗(yan)，結果表明：采用色(se)譜柱(zhu)（1）或（2）及流(liu)動相（1），雖(sui)然(ran)主(zhu)峰(feng)出(chu)峰(feng)時間(jian)適中且峰(feng)形較好(hao)，但各中間(jian)體在(zai)此(ci)流(liu)動相中50min都未(wei)見出(chu)峰(feng)；采(cai)用色(se)譜柱(zhu)（1）或（2）及流(liu)動相（2），樣(yang)品(pin)及各中間(jian)體出(chu)峰(feng)時間(jian)適中，但峰(feng)拖(tuo)尾嚴(yan)重；采用色(se)譜柱(zhu)（3）及流(liu)動相（2），樣(yang)品(pin)及各中間(jian)體出(chu)峰(feng)時間(jian)適中，且峰(feng)形較好(hao)。所以(yi)選(xuan)擇(ze)采用色(se)譜柱(zhu)（3）及流(liu)動相（2）來(lai)檢測(ce)本(ben)品(pin)的(de)有關物(wu)質(zhi)。   
   
    2.3  系(xi)統適(shi)用性(xing)試驗(yan)  取(qu)1.2項溶液(ye)各20μl分別(bie)註入液(ye)相色(se)譜儀進行(xing)測(ce)定，並(bing)記錄(lu)色(se)譜圖，測(ce)定結(jie)果見表1及圖2。試驗(yan)結果表明：巴洛沙(sha)星(xing)與各中間(jian)體在(zai)上述色(se)譜條(tiao)件(jian)下(xia)能有效(xiao)地(di)分離(li)。

表1  巴洛沙(sha)星(xing)與中間(jian)體液(ye)相色(se)譜保留(liu)時間(jian)
Tab.1 Chromatograms retention time of balofloxacin and related substances

 
 

圖2  巴洛沙(sha)星(xing)有關物(wu)質(zhi)系(xi)統適(shi)用性(xing)試驗(yan)HPLC圖
Fig. 2 Chromatograms obtained from the system applicability test of related substances in balofloxacin
1-螯合物(wu)Ⅰ；2-羧酸(suan)乙酯(zhi)；3-螯合物(wu)Ⅱ；4-巴洛沙(sha)星(xing)